1101 – Síntesis de Liposomas para la Encapsulación de Aloe vera como Principio Activo

Tesis para Optar por el Grado de Licenciatura

2017

Síntesis de Liposomas para la Encapsulación de Aloe vera como Principio Activo

Fajardo Robles Dayanne; Vincent Hanson Jendry; PhD. Arguedas Chaverri Eduardo

Universidad De Iberoamérica

Facultad De Farmacia

dcfr@hotmail.es; jenvin_17@hotmail.es; earguedas@unibe.ac.cr

Resumen

El uso de liposomas es muy importante para la encapsulación de principios activos es por eso que por medio de esta

investigación se desea obtener estos a partir de lecitina de soya con el fin de recubrir Aloe vera.

Los liposomas obtenidos, se pueden visualizar con la ayuda de un microscopio y adicionando tinte negro Sudán III a la muestra; además se logra el encapsulamiento del Aloe vera y para comprobar esto se aplica la prueba de Fehling (en presencia de Aloe vera forma un precipitado marrón) y que resulta negativa, lo que indica que si se encapsuló el principio activo.

Se logró la elaboración de los liposomas y la comprobación de que el Aloe vera fue encapsulado por los liposomas.

Palabras claves: liposomas, Aloe vera, encapsulación.

Abstract

The use of liposomes is very important for the encapsulation of active principles; that is why through this research it

is desired to obtain these from soy lecithin in order to coat Aloe vera.

The obtained liposomes can be visualized with the help of a microscope and adding black dye Sudan III to the

sample; In addition the encapsulation of Aloe vera is achieved; and to verify this; the Fehling test is applied (in the presence of Aloe vera it forms a brown precipitate) and that is negative, indicating that the active principle was encapsulated.

The development of liposomes and the verification that Aloe vera was encapsulated by liposomes was achieved.

Key words: liposomes, Aloe vera, encapsulation.

1.Introducción

1.1 Aloe vera Historia

Se cree que el Aloe vera tuvo una aparición en el antiguo Egipto en sus sepulcros y monumentos funerarios desde hace más de 5000 años. Para los egipcios esta planta era muy respetada por su amplio margen terapéutico; ellos le atribuían poderes espirituales y, por eso, en esa época era conocida como la planta de la inmortalidad(1).

La llegada de esta maravillosa planta a América fue por medio de los españoles, los cuales la importaron a la isla Barbados de donde proviene su actual nombre Aloe barbadensis (2).

Habitad y distribución(22)

La sábila es originaria de África o del norte del Nilo; crece de forma espontánea en Sudáfrica y Kenia. Se cultiva principalmente en Venezuela, el Caribe, Texas, Arizona y Florida.

Nombre vientífico y nombres populares(1)

Nombre científico: Aloe vera

Nombres populares: babosa, pulpo, cola de dragón, sábila, bilis de elefante, gluwei, curandero silencioso, planta milagrosa, kumari, lirio del desierto, planta de la inmortalidad, planta que cura, acíbar… entre otros.

Gracias a los amplios estudios que se le han realizado a esta planta se le han atribuido diversas propiedades terapéuticas(3).

Trastornos cardiovasculares.

Estimulador del sistema inmunológico.

Agente antiinflamatorio.

Acelerador de la regeneración de los tejidos.

Antiséptico.

Agente cohesivo e hidratante.

Estimulador del crecimiento de las células.

Problemas bucales.

Inhibe el crecimiento tumoral (Cáncer)

Colitis.

Desarrollo cerebral.

Aporta nutrición.

Dificultades respiratorias (asma, tuberculosis, resfriado, congestión nasal).

Menopausia.

1

Incontinencia nocturna.

Trastornos cutáneos (acné, cicatrices, manchas causadas por la edad, quemaduras, soriasis, salpullidos).

Úlceras (péptica, gástrica).

Composición, principios activos y propiedades

de la hoja de Aloe vera(10,24,25,26)

La hoja de Aloe vera está compuesta en un 99%-99,5% de agua y el 0,5%-1% contiene aproximadamente 75 componentes que incluyen: vitaminas, minerales, enzimas, azúcares, antraquinonas, lignina, saponinas, esteroles, aminoácidos y ácido salicílico.

La parte utilizada es la hoja, la cual está compuesta por tres capas:

1.Capa interna de gel incoloro

Está constituida por un 99% de agua, la cual otorga propiedades hidratantes al ser administradas sobre la piel.

Figura 1.1.1. Estructura molecular del

agua

Aminoácidos: el Aloe vera provee 20 de los 22 aminoácidos necesarios por el cuerpo humano; y 7 de los 8 aminoácidos esenciales que el cuerpo no puede sintetizar. Las proteínas formadas a partir de estos aminoácidos inhiben el crecimiento de tumores y úlceras, y aumenta la proliferación normal de las células de la piel humana.

Vitaminas: aportan nutrición e importante acción antioxidante (vitamina A, C y E); vitamina B (tiamina), niacina, vitamina B2 (riboflavina), colina y ácido fólico. También se cree que contiene concentraciones mínimas de vitamina B12.

Enzimas: lipasa y amilasa; las cuales ayudan a la digestión de grasas y azúcares. Igualmente presenta una enzima carboxipeptidasa que inactiva la bradicinina por medio de hidrólisis inhibiendo el efecto doloroso e inflamatorio que produce esta; de ahí el efecto analgésico que se le atribuye a esta planta.

Minerales: calcio, sodio, potasio, magnesio, cobre, zinc, hierro y cromo. El lactato de magnesio inhibe la descarboxilación de la histidina y previene la formación de histamina que se forma a partir del aminoácido histidina.

La histamina es liberada durante las reacciones alérgicas lo que provoca prurito intenso entre otras manifestación; por este medio se justifica el efecto antipruriginoso del Aloe vera.

∙ Azúcares del tipo monosacáridos y polisacáridos; los más importantes son los polisacáridos de cadena larga que están constituidos por glucosa y manosa; conocidos como glucomananos l (acemanano), el cual

posee propiedades inmunoestimulantes, antivirales, antineoplásicas y gastrointestinale

Figura 1.1.2 Estructura molecular del

acemanano

Ácido salicílico: principio activo presente en la aspirina con propiedades antiinflamatorias, antipiréticas y analgésicas.

Figura 1.1.3 Estructura molecular del ácido

acetilsalicílico.

2.Capa intermedia o látex: savia amarilla amarga que contiene antraquinonas (aloína, aloe- emodina y emodina); los cuales actúan como

inmunoestimulantes,antivirales, antineoplásicos y gastroprotectores.

Figura 1.1.4 Estructura molecular de la aloína

2

Figura 1.1.5 estructura molecular de aloe emodina

Figura 1.1.6 estructura molecular de la emodina

3.Capa externa gruesa “corteza”: la cual tiene la función de protección y síntesis de proteínas.

Figura 1.1.7 Corte transversal de hoja de

Aloe vera y sus capas.

1.2Liposomas. Historia(4)

El campo de la liposomología tiene origen en el trabajo de Alec Bangham y sus colegas en el instituto de investigación agrícola de la fisiología animal en Babraham, Cambridge en los años 60.

En 1964 Bangham y una de sus colegas Horne

realizan y describen una observación microscópica electrónica de la fosfatidilcolina (lecitina) y su mezcla con colesterol disperso en agua; observaron “esferulitos” de pequeño y gran tamaño producidos por una agitación manual o por sonicación.

Un año después en 1965 Bangham compartió que

“la difusión que realizan los cationes y aniones a través de la membrana del liposoma formado de la lecitina es notablemente similar a la difusión que realizan estos iones a través de membranas biológicas”.

¿Qué son los liposomas?

Los liposomas son vesículas compuestas por una o más bicapas lipídicas concéntricas que encierran un número igual de compartimientos acuosos. Las bicapas se encuentran formadas por fosfolípidos y colesterol, se dice que la organización es semejante a la membrana celular(11).

Tipos de liposomas y sus características (4),

(12)

Unilaminares pequeños (SUV): su tamaño está entre 20-70 nm; presentan un solo compartimento central acuoso y una pared de fosfolípidos

Unilaminares grandes (LUV): su tamaño va de 70-400 nm; estos también poseen un solo compartimento acuoso y una sola pared de fosfolípidos.

Vesículas multilaminares (GUV, MLV): su tamaño va entre 10-100 nm; está formado por múltiples paredes de fosfolípidos y varios compartimentos acuosos concéntricos.

Figura 1.2.1 Tipos de liposomas

Principales usos de los liposomas(7)

La utilización de liposomas para el recubrimiento de Aloe vera va a favorecer la estabilidad del principio activo para así evitar su rápida descomposición, y de esa manera poder

desarrollar nuevos productos con alta biodisponibilidad en el organismo, logrando así una mejor concentración y a la vez aprovechar sus propiedades terapéuticas.

Ventajas de los liposomas(7)

Aumento de la eficacia y la disminución de la toxicidad del principio activo encapsulado.

Prolongación del efecto.

Mejor absorción, penetración y difusión.

Posibilidad de vías de administración alternativas.

Estabilización del principio activo.

3

Clasificación de los liposomas(5,14,16)

Según el método de obtención:

Método de dispersión simple.

Este método se realiza en tres etapas:

1.Liofilización o evaporación: para la obtención de la bicapa lipídica a partir de disoluciones de lípido en medios no polares. Los lípidos se disuelven en disolventes orgánicos como cloroformo o ciclohexano. La disolución de los

distintos lípidos se realiza en proporciones adecuadas. El disolvente se evapora por medio de una bomba de vacío o con ayuda de una corriente de Ar o N2 obteniéndose una fina película formada por la bicapa lipídica sobre las paredes del vial con que se trabajará. En esta etapa, por lo general, se utiliza un rotavapor para agilizar el proceso de evaporación.

2.Hidratación: de la bicapa lipídica y dispersión en medios polares como agua o disoluciones tampón. La hidratación debe realizarse por encima de la temperatura de transición del lípido durante 30 minutos y con ayuda de un agitador mecánico. Esto ayuda a que parte del agua quede atrapada en la bicapa lipídica y el resto queda inmerso en el interior del liposoma, el cual se forma espontáneamente en contacto con la disolución acuosa.

3.Extrusión de fosfolípidos: esto se realiza para obtener liposomas de un tamaño más homogéneos. Los liposomas se hacen pasar por un filtro de policarbonato de un tamaño y poro definido, en el cual quedarán atrapadas únicamente las bicapas que no han formado liposomas.

Método de inyección de etanol o éter. En este método se realizan tres pasos fundamentales; primero se disuelven los lípidos a utilizar en etanol o éter; luego la disolución se inyecta rápidamente en una solución tampón; lo que da lugar a la formación de liposomas de forma espontánea. Por último se realiza una ultrafiltración para eliminar los posibles restos de etanol o éter según el disolvente utilizado

Diálisis de detergente.

Aquí los liposomas se preparan mezclando detergente y fosfolípidos, lo que da lugar a la formación de micelas

mixtas, de forma que una vez que se dializa (la solución se introduce en una bolsa de diálisis cuyo tamaño de poro permite la salida del detergente, pero no del liposoma)(6) el detergente se obtienen liposomas unilaminares.

Método de evaporación en fase reversa.

Utiliza un volumen muy pequeño de fase acuosa en la solución orgánica en la que están inmersos los fosfolípidos (relación molar 1:3). Después de agregar la fase acuosa por encima de la temperatura de transición del lípido la mezcla se sónica dando lugar a una emulsión Luego la fase orgánica se elimina a presión reducida, dando lugar a liposomas en una fase de gel intermedio.

Finalmente, tras una fuerte agitación se obtiene una disolución concentrada de liposomas muy polidispersas desde pocos nanómetros hasta 10 micrómetros, según la composición y la concentración de los lípidos, la temperatura, la fuerza de sonicación y el tiempo. Los liposomas obtenidos por medio de este método no son estables para el almacenamiento a

temperaturas por debajo de la temperatura de transición del lípido, ya que los liposomas tienden a fusionarse.

En todos los métodos previamente descritos, excepto el método de evaporación en fase reversa, los liposomas obtenidos se deben almacenar a una temperatura entre 4-8°C a pH 7. Su estabilidad por lo general es de una semana.

Según los campos en los que se utiliza y aplicaciones terapéuticas

Dirigido a terapia anti- infecciosa.

Dirigido a terapia antineoplásica.

Dirigido a terapia para la desintoxicación por metales.

Dirigido al campo dermatológico.

Entre otras.

Principales fuentes lipídicas para la preparación de liposomas(11)

Fosfatidilcolina de yema de huevo.

Colesterol.

Esfingomielinas; las cuales se encuentran en la sangre, sustancia blanca del SNC (principalmente en la vaina de mielina) y tejidos de los seres humanos.

4

Ácido fosfatídico.

Cardiolípido.

Lisofosfatidilcolina; el cual se encuentra en la lecitina como fosfatidilcolina.

Interacción célula liposomas

Las diferentes formas de interacción entre los liposomas y las células se dan por:

Endocitosis: aquí la célula se invagina y rodea al liposoma permitiendo su entrada para la posterior liberación del principio activo.

Fusión: aquí el liposoma se fusiona con la célula y libera el principio activo dentro dicha célula. El liposoma llega a ser parte de la estructura final de la célula.

Adsorción: aquí los liposomas se adhieren a las células diana y por medio de transporte pasivo el principio activo pasa a través de la membrana liposomal y la membrana celular al interior de la célula.

Intercambio lipídico: aquí se da el intercambio de lípidos entre el liposoma y la célula; este tipo de interacción permite la absorción de fármacos lipofílicos que se encuentran en la zona lipofílica del liposoma.

Figura 1.2.2 Formas de interacción entre liposomas

ycélulas.

2.Materiales y método

Para la realización de esta tesis se procedió a la utilización de equipos especializados para la elaboración de los distintos procedimientos del método de obtención de liposomas como: balones de fondo plano para llevar a cabo las soluciones,

agitador mecánico para una mejor homogenización de la mezcla y el microscopio para la visualización de los liposomas.

Con respecto al método utilizado para la obtención de liposomas:

Obtención de liposomas utilizando lecitina de soya, aceite de soya, colesterol y polisorbato 80.

Pesar 7g de lecitina de soya, pesar 2g de aceite refinado de soya, agregar a un Beaker de 250ml lo que se pesó anteriormente y agregar 10ml de la solución de NaCl 1×10-5 M, agitar con agitador

magnético hasta formar la fase lamenar, tomar 5g de la fase lamenar, agregar 5ml de ácido Algínico

,3g de polisorbato 80, 1g de colesterol y 85ml de agua destilada, realizar agitación mecánica por 30 minutos a 1150rpm y observar al microscopio.

Encapsulación del Aloe vera

Pesar 7g de lecitina de soya, pesar 2g de aceite refinado de soya, agregar a un Beaker de 250ml lo que se pesó anteriormente y agregar 10ml de la solución de NaCl 1×10-5 M, agitar con agitador magnético hasta formar la fase lamenar, tomar 5g de la fase lamenar, agregar 5ml de ácido Algínico

,3g de polisorbato 80, 1g de colesterol y 85ml de agua destilada, agregar 10mg del liofilizado de Aloe vera, realizar agitación mecánica por 30 minutos y observar al microscopio.

Comprobación del encapsulamiento del Aloe vera por los liposomas

Por medio de la prueba de fehling se puede lograr comprobar la encapsulación, de manera que esta prueba revela la presencia de azúcares. Se toma una pequeña cantidad de la muestra con el principio activo encapsulado, se coloca en un tubo de ensayo y se le adiciona reactivo de fehling; observar si hay cambios de color o algún precipitado.

3. Resultados y discusión

Desde el punto de vista científico la obtención de liposomas para la encapsulación de principio activos, para uso dermatológico, es sumamente importante y de gran utilidad en la industria cosmetológica, es por esto que en esta tesis se buscó la obtención de liposomas a partir de lecitina de soya granulada y aceite refinado de soya para encapsular Aloe vera como principio activo. Dado a que este presenta un gran número de componentes que le atribuyen diversas propiedades beneficiosas como: dermatología, gastroenterología, inmunología, oncología entre otros campos. Todas estas propiedades se pueden ver favorecidas a nivel de la absorción en presencia de liposomas ya que estos presentan propiedades físicas-químicas que permiten el control de la liberación de los principios activos.

La primera parte consistió en elaborar liposomas estables, eventualmente se obtuvieron lo cual se puede observar posteriormente

5

ende el Aloe vera al tener azucares reductoras debe dar negativo (color azul), evidencia que la mayor parte del liofilizado de Aloe vera fue encapsulado.

Figura 3.1 Liposomas multilaminares

Estos fueron liposomas multilaminares, fueron almacenados bajo refrigeración a una temperatura entre 2°C y 8°C. Una semana después se analizaron nuevamente bajo microscopio y se observó los liposomas con gran estabilidad y homogeneidad en su tamaño.

Figura 3.2 Liposomas una semana después

Para comprobar la estabilidad se siguieron observando los liposomas en el transcurso del tiempo; lo que se observaron estables.

Para una fácil visualización se empleó el tinte negro Sudán III, el cual solo tiñe los lípidos, por tanto al agregar el tinte a la muestra este se adhiere de forma específica a la bicapa fosfolipídica del liposoma, permitiendo así su fácil determinación.

Figura 3.3 Diferencia entre liposomas teñidos y no

teñidos

Finalmente para verificar que el proceso de encapsulación fue efectivo se realizó la prueba con el reactivo de Fehling, la cual en presencia de azucares reductores da un precipitado marrón, por

Figura 3.4 Foto de prueba con reactivo de Fehling.

Figura 3.5 Liposomas con liofilizado de Aloe vera

encapsulado

Conclusiones

Se logró la elaboración de liposomas a partir de lecitina de soya y aceite refinado de soya.

Se puede mantener la estabilidad de los liposomas a temperaturas de 2° C y 8° C.

El colesterol ayuda a aumentar la estabilidad de la estructura de la membrana liposomal.

Desde el punto de vista farmacéutico y cosmético se logran ver los amplios beneficios que brindan los liposomas.

El aloe vera como principio activo

presenta múltiples propiedades beneficiosas.

Se logró comprobar que el liofilizado de Aloe vera fue encapsulado por los liposomas.

Se pudo visualizar los liposomas al microscopio al utilizar el tinte negro sudán III.

La agitación es un factor que influye directamente en la formación de los liposomas.

6

Recomendaciones

∙ Elaborar liposomas utilizando las cápsulas de lecitina de soya, con el objetivo de omitir el primer paso de elaboración y agilizar el proceso.

Realizar pruebas de titulación para determinar de forma más específica la efectividad de la encapsulación del Aloe vera.

Aumentar las cantidades de Aloe vera por encapsular y realizar de forma constante la prueba de Fehling para determinar la cantidad máxima que se puede encapsular.

Realizar la encapsulación con gel de Aloe vera utilizando un equipo microscopio especializado con inyector de canaleta.

Utilizar diferentes polisorbatos para

poder ver si existe diferencia significativa en el grosor de la membrana de los liposomas que se obtienen.

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7

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