1110 – Análisis fitoquímico de la semilla de Persea americana Mills (aguacate) y evaluación de su actividad antioxidante

Análisis fitoquímico de la semilla de Persea americana Mills (aguacate) y evaluación de su actividad antioxidante

Universidad de Iberoamérica, Facultad de Farmacia

Ximena Zúñiga Hernández, MsC. Marco Calvo Pineda, MsC. Susan Hío Sequeira

Resumen

En la actualidad se da la búsqueda constante de nuevas alternativas terapéuticas con enfoques más naturalistas para el tratamiento de ciertas patologías que día a día acechan nuestra sociedad como las enfermedades asociadas al estrés oxidativo. El aguacate (Persea americana Mill) es una fruta con un alto valor nutricional, que durante siglos ha sido de gran consumo en nuestro país y en el continente americano, sin embargo, hasta pocos años se ha empezado a estudiar los productos de desecho de esta fruta, como la cáscara y la semilla para determinar las propiedades que estos poseen en la salud. La semilla de aguacate ha resultado de interés puesto que en estudios recientes ha demostrado tener actividad antibacteriana, anticonceptiva, antifúngica, antihelmíntica, entre otras. El presente estudio por su parte busca determinar el potencial antioxidante de la semilla de aguacate por medio del método DPPH (1,1‐difenil‐2‐picrilhidrazil) y busca además compararlo con el potencial antioxidante del ácido ascórbico, que es uno de los antioxidantes con gran potencial altamente conocido. Así mismo, complementario al estudio se realiza análisis fitoquímicos a la semilla mediante pruebas de color, técnicas cromatográficas y espectroscópicas.

Palabras claves: Persea america Mill, aguacate, antioxidantes, estrés oxidativo, DPPH.

Abstract

At present, there is a constant research for new therapeutic alternatives with naturalistic approaches for the treatment of certain pathologies that day by day are haunting our society such as diseases associated to the oxidative stress. The avocado (Persea americana Mill) is a fruit with a high nutritional value, that during centuries has had a great consumption in our country and in the American continent, nevertheless, until a few years ago there are studies to determinate the properties of the waste products like the seeds and the husk of this fruit possess in health. Avocado seed has been of interest since recent studies have shown antibacterial, contraceptive, antifungal and anthelmintic activity, among others. The present study aims to determinate the antioxidant potential of avocado seed using the DPPH (1,1‐diphenyl‐2‐picrylhydrazyl) method and also seeks to compare it with the antioxidant potential of ascorbic acid, which is one of the antioxidants with great potential highly known. Also, complementary to the study, there is a phytochemical analyzes to the seed through color tests, chromatographic and spectroscopic techniques.

Key words: Persea america Mill, avocado, antioxidants, oxidative stress, DPPH.

Introducción

Los radicales libres son sustancias consideradas como especies reactivas o inestables. Este puede ser un átomo o un conjunto de estos que contienen al menos un electrón que no se encuentra apareado, y estos al estar cargados negativamente lo que vuelve a la molécula inestable. Al estar estos desapareados, lo electrones buscan de alguna manera aparearse para poder estabilizarse, causando perturbación o alteración en cualquier molécula que se encuentre cercana a esta, produciendo así cambios moleculares, celulares, bioquímicos, genéticos, una reacción en cadena que finaliza causando daños al organismo que en algunos casos resultan irreversibles. Estas sustancias se encuentran en el organismo de manera natural en pequeñas proporciones como causa de muchos procesos bioquímicos que ocurren en nuestro organismo, que en situaciones normales estos se encuentran en niveles normales. (28).

Es fundamental, sin embargo, que los niveles de radicales libres se mantengan controlados en niveles normales, puesto que niveles elevados de radicales libres, estimula una producción de mayor cantidad de los mismos.

El control de radicales libres en el organismo está mediado por agentes antioxidantes. Este tipo de sustancias deben estar en equilibrio con las sustancias oxidantes de manera que estas últimas no representen un daño para el propio organismo.

Estos agentes son los encargados del control de las especies reactivas que se produzcan en el organismo, y este tipo de sustancias se obtienen de manera endógena o exógena.

Existen dos vías principales para el control de estas especies reactivas, una es de tipo enzimática, como es el caso de la enzima catalasa, el glutatión peroxidasa, el superóxido dismutasa, y la otra de tipo no enzimática, (estas de tipo no enzimática pueden ser endógenas o exógenas), en esta última vía es donde intervienen los antioxidantes. (33)

El árbol de aguacate data desde hace aproximadamente 8000 años antes de Cristo, desde ese entonces se ha cultivado en América y ha sido un importante fruto dentro de las culturas mesoamericanas. (1)

Actualmente este fruto es cultivado en todo el mundo durante todo el año. Su consumo es de gran relevancia en países como México, así mismo, su consumo es muy popular a nivel mundial.

La Persea americana es un fruto rico en agua y grasas de tipo monoinsaturadas que resultan beneficiales a organismo, así mismo posee un pequeño porcentaje de grasas saturadas y poliinsaturadas. Sin embargo, además de ser un fruto rico en estas grasas como el aceite oleíco y linoleíco, también resulta ser un fruto rico en proteínas, carbohidratos, fibra, así mismo contiene un buen número de vitaminas que son excelentes para el organismo como la vitamina B1, B2, B6, vitamina C, A, E y asimismo contiene minerales como potasio, magnesio, fósforo, sodio, calcio, hierro, contiene ácido fólico, niacina. (8)

En los estudios sobre P. americana, se ha encontrado componentes aislados a los cuales se les ha asociado actividad farmacológica tales

como: antihelmíntico, antiespasmódico, antibacteriana.

Según la manera en que se consuma las partes de esta planta tiene diversos efectos farmacológicos, es decir, si se consume un extracto, o una infusión, o el consumo directo del fruto. De esta manera, el extracto en metanol de la hoja y el tallo, presenta efectos antibacterianos contra bacterias de tipo gram positivo como el Staphylococcus aureus, así mismo su extracto acuoso o en etanol presenta un efecto diferente de tipo espasmogénico, (probado en animales como conejos y cobayos), y un efecto antiespasmódico para el extracto acuoso de la hoja y el fruto. Por otra parte la cáscara ha presentado efectos antibacterianos reportados a partir de su composición. A nivel de extractos de la semilla se ha reportado actividad de tipo antibacteriana,

bactericida, anticonceptiva, antifúngica, antihelmíntica, esto contra especies como S aureus, Bacilus subilis, shiguella, salmonella, Candida albicans, solitaria, Escherichia coli. (7)

Se han reportado además estudios que la semilla de aguacate ayuda a reducir triglicéridos, colesterol, reduce así el riesgo de ataques cardiacos, y problemas asociados al aumento de este tipo sustancias en el cuerpo.

Metodología

Preparación del extracto

Para la preparación del extracto se tomó las semillas de aguacate previamente lavadas y secadas al ambiente, posteriormente se procedió a rallarlas con ayuda de un rallador utilizando su parte más fina. La muestra fue colocada en una bandeja para realizar secado al ambiente. Cuando la muestra se encontraba completamente seca y libre de humedad, se realizó extracción etanólica con ayuda de un Soxleth, donde se dejó realizar un mínimo de ocho sifones para su posterior retiro de

la muestra. El extracto líquido de la muestra de semilla de aguacate se sometió a rotavaporación donde se extrajo la mayor cantidad de etanol para que la muestra se concentrara.

Análisis de pruebas de color

Se realizaron dos fases de pruebas de color, una fue con el extracto natural, utilizando una gota del extracto diluida en 1mL de H2O. Posteriormente se realizó prueba de Magnesio (Mg), FeCl3, Drangendorff y Molish. Se utilizó un tubo de ensayo para cada prueba.

Cromatografía de columna

Se realizó una cromatografía de columna con el extracto una vez que este estaba semisólido. Se tomó una muestra de dos puntas de espátula aproximadamente y se colocó en la columna una vez que esta ya contenía el gel de sílica. Se hizo un primer corrido de hexano para humedecer el gel de sílica, este corrido se descartó. Se puso a correr el extracto con cinco fases móviles de diferente proporción: A) 90:10mL hexano‐acetato de etilo, B) 50:50mL hexano‐acetato de etilo, C) 90:10mL acetato de etilo‐hexano, D) 100mL acetato de etilo y E) 100mL metanol. Se recolectaron siete fracciones por cada fase móvil, señaladas desde A1 hasta A7, B1 hasta B7, y así sucesivamente con las fracciones restantes. Se procuró mantener volúmenes similares en todas las fracciones.

Se realizó pruebas de color a dos fracciones por cada línea de fase móvil realizada, con reactivo de FeCl3, Dragendorff y con vapores de amoniaco.

Cromatografía de capa fina

En placa cromatográfica de sílica, se colocaron tres puntos correspondientes a muestra de tres diferentes fracciones. Se utilizó una fase móvil de hexano y acetato de etilo al 3:1. De cada línea de

fracción se analizó al menos tres muestras. Las placas se revelaron con luz UV.

Se realizó además un análisis a ciertas fracciones de la línea del B y C comparándolas con atropina, donde se utilizó una fase móvil con 9mL de cloroformo, 2mL de ciclohexano y 1mL de dietilamina y se hizo revelado con Dragendorff.

Prueba de antioxidantes según método DPPH

Preparación del extracto

La disolución madre del extracto se realizó en una concentración de 50/1000mL y la disolución de trabajo de 1/10mL con solvente metanol.

Preparación de la disolución madre y trabajo de

DPPH

La preparación de las disoluciones madres y de trabajo de DPPH y de ácido ascórbico se realizó siguiendo el método de Determinación de Capacidad Antioxidante mediante DPPH, propuesto por Gutiérrez S. y Alfaro K., (27). Con modificaciones en la preparación de la disolución de trabajo de DPPH, la cual se realizó al 10/50mL, y la de trabajo del ácido ascórbico que se realizó al 2.5/100mL, con solvente metanol en ambas.

Espectrometría UV

Se tomó cuatro de las fracciones que dieron positivo en la prueba de vapores de amoniaco, se utilizó las fracciones E5, E6 E7 y C7; estas se diluyeron en metanol, posteriormente se llevaron al equipo de ultravioleta visible y se realizó un barrido en una longitud de onda entre 200nm‐ 500nm, con la finalidad de determinar picos de absorbancias significativos.

Discusión y resultados

En el análisis de pruebas de color para el extracto puro se tuvo resultado positivo en carbohidratos (prueba de Molisch) y compuestos fenólicos. Así mismo con los análisis realizados a las fracciones obtenidas de la cromatografía de columna, se obtuvo resultados positivos en presencia de alcaloides, cumarinas e igualmente compuestos fenólicos. Estos pues dieron positivo en las pruebas de Dragendorff, vapores de amoniaco y FeCl3.

En la cromatografía de capa fina se observó que la presencia de alcaloides radicaba mayormente en las fracciones de la línea del B y C.

Figura 1. Resultado de prueba de coloración con Dragendorff de la fracción C6 y B7 en comparación con atropina.

El resultado del análisis de espectrometría UV corroboró la presencia de compuestos fenólicos al menos en las fracciones correspondientes a la línea de E (E5, E6, E7) cuyos principales picos de absorbancia fueron mayores a una longitud de onda cercana al 274nm.

Figura 2. Espectro UV‐Visible de fracción E5 diluido en metanol.

Figura 3. Espectro UV‐Visible de fracción E6 diluido en metanol.

Figura 4. Espectro UV‐Visible de fracción E7 diluido en metanol.

Prueba de antioxidantes por método DPPH

Para la prueba de antioxidantes se obtuvo las siguientes curvas que permitieron determinar el

IC50 del ácido ascórbico y del extracto de la semilla de aguacate.

Gráfico 1. Curva de calibración del ácido ascórbico

Gráfico 2. Curva de calibración de extracto de extracto de semilla de aguacate.

Para los IC50 obtenidos gracias a estas curvas, se obtuvo el siguiente cuadro

Cuadro 1. Cuadro comparativo de concentración antioxidante que causa una disminución en la absorbancia DPPH del 50%.

IC50 Ácido ascórbico

3.20 mg/L

IC50 Extracto semilla de

0.11 mg/L

aguacate

Con estos resultados se puede observar que el extracto de semilla de aguacate tiene un potencial antioxidante siete veces mayor al del ácido

ascórbico. Que si bien no es tan alto, compite con uno de los considerados mejores antioxidantes para el organismo.

Conclusiones

Se concluye que acorde con lo señalado por la teoría, se identificaron varios compuestos dentro del análisis fitoquímico que anteriormente le habían sido atribuidos a la semilla de aguacate, como la presencia de carbohidratos, alcaloides, cumarinas y compuestos fenólicos.

La semilla de aguacate demostró tener un potencial antioxidante mayor en comparación con el del ácido ascórbico (Vitamina C), que puede ser atribuible a la presencia de compuestos fenólicos. Esto resulta de gran aporte ya que dado a esto no solo puede generar efectos antioxidantes ante la oxidación lipídica del mismo fruto, sino que pueden estudiarse sus efectos antioxidantes en el organismo humano.

La semilla de aguacate demuestra ser un producto que puede resultar beneficial para la salud como antioxidante.

Existe además un aporte a disminuir el impacto ambiental ya que la semilla de aguacate es considerada material de desecho.

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