1113 – Identificación de fitoesteroles y antioxidantes fenólicos a partir de la harina de malanga

Identificación de fitoesteroles y antioxidantes fenólicos a partir de la harina de malanga

Rebeca Bernard-Betancu, Zurika Morales- Wilson y Eduardo Arguedas- Chaverri, Lissette Rodríguez- Yebra.

Resumen

El consumo de productos naturales ha incrementado tanto a nivel mundial como nacional, en estos se pueden encontrar una serie de compuestos metabólicos que pueden ser empleados en las ciencias de la salud.

La Colocasia Esculenta es un tubérculo familia de las aráceas, el cual posee múltiples beneficios al consumirlo de manera habitual, dentro de sus componentes podemos encontrar: vitaminas, minerales, antioxidantes entre otros. Diversos estudios demuestran los efectos de la malanga sobre el organismo, se incluyen fines medicinales como la capacidad antioxidante y propiedades anti- inflamatorias así como su eficacia para tratar la gastritis y mejorar los síntomas que se presentan durante la menopausia

En el presente estudio se realizó una evaluación comparativa por métodos químicos (cromatográfico y espectroscópicos) cromatografía de gases acoplada a masas para evaluar la presencia de los componentes principales metabólicamente. Se evaluó y se confirmó la presencia de antioxidantes polifenolicos presentes en las muestras de malanga, al igual que los fitoesteroles naturales, el campesterol, sigmasterol y gama sitoesterol con posible actividad estrogénica, además los fitoesteroles poseen un efecto protector del endotelio vascular.

Palabras claves: Colocasia Esculenta, antioxidantes polifenolicos, fitoesteroles, malanga.

Abstract

The consumption of natural products has increased both globally and nationally, in these can be found a number of metabolic compounds that can be used in the health sciences.

The Colocasia Esculenta is a tuber family of the arces, which has multiple benefits to consume it in a habitual way, within its components we can find: vitamins, minerals, antioxidants among others. Several studies show the effects of malanga on the organism, include medicinal purposes such as antioxidant capacity and anti-inflammatory properties as well as its efficacy to treat gastritis and improve the symptoms that appear during the menopause

In the present study we performed a comparative evaluation by chemical methods (chromatographic and spectroscopic) gas chromatography coupled to masses to evaluate the presence of the principal components metabolically. The presence of polyphenol antioxidants present in the malanga samples was evaluated and confirmed, as well as the natural phytosterols, campesterol, sigmasterol and gamma sitoterol with possible estrogenic activity. In addition, the phytosterols have a protective effect on the vascular endothelium.

Key words: Colocasia Esculenta, polyphenol antioxidants, phytosterols, malanga.

Introducción

La malanga (Colocasia Esculenta), es originaria del sureste de Asia, es herbacia de forma ovoide con una pulpa blanca, almidonosa y cascara color marrón (1)

El tallo central es elipsoidal es conocido como un cormo rico en carbohidratos y proteínas (1) además de ser altamente digestivo por lo que es un alimento excelente para consumo humano, animal además tiene usos industriales (4)

Posee carbohidratos, proteínas e índice bajo en lípidos (1). Los polifenoles inhiben la tasa de actividad de los procesos enzimáticos digestivos, muchas enzimas son inhibidas, por ejemplo, hidrolasas, fosfoquinasa, proteinoisomerasas y oxigenasas. (5).

Los ácidos fenólicos tienen actividad antioxidante fuerte y presentan acciones antivirales, antiinflamatorias, antibacterianas y vasodilatadoras (7).

Los polifenoles son los compuestos bioactivos antioxidantes más abundantes en la dieta. Son producto del metabolismo secundario de las plantas, donde desempeñan diversas funciones de protección al ataque de patógenos o herbívoros y son pigmentos que atraen a los polinizadores. Poseen estructuras con anillos aromáticos y dobles enlaces conjugados a partir de los cuales ejercen su acción antioxidante (8).

Los compuestos fenólicos están relacionados con la calidad sensorial de los alimentos de origen vegetal tanto frescos como procesados. (2)

El consumo de frutas y vegetales ha sido asociado con una menor incidencia de mortalidad por diferentes enfermedades crónicas (6)

Se desea relacionar la presencia de fitoesteroles en la malanga con posible actividad estrogénica, para el uso en la menopausia, también conocido como climaterio,el último periodo menstrual de una mujer. Es una interrupción permanente del sangrado menstrual, como consecuencia de la perdida de la activación folicular ovárica. En este proceso los ovarios disminuyen la producción de estrógenos y progesterona. (7)

La Colocasia Esculenta es de suma importancia para tratar los trastornos relacionados con la menopausia debido a que los fitoesteroles encontrados van a ayudar a aumentar estrógenos y al aumentar estos se incrementa glutatión y cuando aumenta glutatión se van a incrementar aminoácidos precursores de neurotransmisores son estabilizadores del SNC

Hay numerosas evidencias científicas, mediante estudios clínicos controlados, en las que se indica; que el consumo de fitoesteroles o estanoles en dosis de 1,5-4 g/día disminuye la colesterolemia en promedio de 10%, con una variabilidad entre 5 y 25%.

Esto ocurre, aunque la dieta sea baja en colesterol, porque la bilis transporta grandes cantidades de colesterol al intestino, cuya reabsorción se dificulta o se ve interrumpida cuando se ingieren esteroles vegetales. (7)

Los fitoesteroles moléculas de origen vegetal con una estructura química similar a los estrógenos. Se dividen en fitoesteroles y fitoestanoles. Se les atribuyen acciones favorables para órganos como las mamas y la próstata, para el tejido óseo, y cualidades que mejoran la sintomatología asociada a la menopausia. (9)

La Colocasia Esculenta se puede utilizar en la gastritis debido a la presencia de antioxidantes porque estos disminuyen la inflamación de la mucosa gástrica.

Materiales y métodos

Método 1: Harina de Malanga

Se pesa la malanga con cáscara, una vez pesada se procede a pelarla quitándola en su totalidad, se pesan nuevamente.

Se cortan en rodajas de 0.5cm de espesor y se colocan en una bandeja para horno, a 65°C por 24 horas, posteriormente se colocan las rodajas en la licuadora industrial hasta reducir en partículas y se pasan por una malla para obtener la harina lo más fina posible.

Método 2: extracción continúa utilizando el equipo de destilación simple

Se pesan 50 gramos de la harina de Malanga en cada uno de los balones, se realizaron tres extractos con el solvente correspondiente, extracto A (hexano), extracto B (cloroformo) y extracto C (metanol). Se colocaron en diferentes equipos de destilación simple con 150 mL de cada solvente, se calentaron según la temperatura de ebullición de cada solvente.

Una vez concluido el tiempo estimado se procedió a dejar enfriar cada extracto y recolectarlo en frascos de vidrio, estos se tapan y se dejaron concentrar por 22 días.

Método 3: evaluación cromatográfica

Se realizaron 3 placas cromatograficas para determinar cuál de los solventes utilizados logró separar mejor los componentes en cada muestra.

Los extractos fueron analizados utilizando cromatografía de capa fina empleando como fase estacionaria gel de sílice. En cada caso se utilizaron cromatoplacas de 4cm de ancho y 8 cm de largo,a 1cm de la base. Las fases móviles utilizadas fueron: para la placa 1 (acetato de etilo y cloroformo), placa

2:(cloroformo y metanol) y placa 3: (acetato de etilo y metanol) para todas las fases móviles se usó una proporción de 1:1. Se colocan en beakers de 400ml y se tapan con papel aluminio.

Para detectar los diferentes compuestos, se observan las placas bajo luz UV(de onda larga y corta) y se revelan con vapores de yodo.

Método 4: columna cromatografica

Se utilizó una columna que posee un filtro incluido, se preparó el equipo que se utilizó y se lavó la columna con el solvente a empleado (metanol- acetato de etilo). Se pesaron 30gramos de silica y se fueron disueltos con un poco de la fase móvil, ésta utilizada tiene una proporción 1:1 (100 mL de cada uno).

La silica se compactó con la fase móvil y se agrega 2cm de muestra, esta muestra debía de bajarse al límite de la silica al menos 3 veces para introducir la muestra en la fase estacionaria. Se recolectaron 30 tubos de ensayo con muestras alrededor de 2cm.

Se realizó una placa cromatografica con 20 muestras elegidas al azar con la misma fase móvil. El agente revelador empleado fueron los vapores de yodo, las muestras que presentan desplazamientos fueron agrupadas según las coincidencias de las marcas, y son recolectadas de la misma manera.

Método 5. Prueba de Folin

Se realiza una disolución madre, con 0,1000 de ácido gálico en un balón de 50mL, se afora con etanol al 40%, se coloca en el baño ultrasónico durante 5 minutos.

De la disolución madre se extrae una alícuota de 10mL, en un balón de 25mL y se afora con etanol al 40%. Se preparan 10 balones de 10mL, a los cuales se le agregó ácido gálico (0- 0,2- 0,4-0,6-0,8-1-1,2-1,4-1.6 mL) respectivamente y se aforó con agua destilada.

De los balones anteriores se tomó 0,25mL de cada uno y se colocó en balones de 25mL respectivamente, en cada uno se colocó 15mL de agua destilada, 0,8mL de Folin, se homogenizó el contenido, y se dejó reposar en la oscuridad durante 8 minutos. Una vez transcurrido el tiempo a cada balón en el respectivo orden se agregó 3,75mL de carbonato de sodio al 7,5%, se lleva a un volumen de 25mL con agua destilada.

Se homogenizaron los balones y se mantuvieron en la oscuridad durante 2 horas .Se midió la absorbancia a 681nm y 755nm, para la preparación de la curva de ácido gálico.

Método 6. Preparación de las muestras de Folin

Muestra 1

Se pesó 0,0700 de la harina de malanga, se le agregó un poco de etanol al 40% y se colocó en el baño ultrasónico durante 10 minutos, se aforó con etanol al 40%, una vez aforado se filtró con el trompo.

Se extrajo 0,25mL de la muestra, se coloca en un balón de 25mL, se agregó 15mL de agua destilada, 0,8mL de Folin, se homogenizó el contenido, y se dejó reposar en la oscuridad durante 8 minutos.

Una vez transcurrido el tiempo a cada balón se agregó 3,75mL de carbonato de sodio al 7,5%, se llevó a un volumen de 25mL con agua destilada. Se homogenizaron los balones y se mantuvieron en la oscuridad durante 2 horas. La coloración cambia de amarillo a azul. Se midió la absorbancia a 755nm.

Muestra 2

Se pesó 0,0700g de la harina de malanga en un balón de 10mL, se le agregó un poco de la mezcla de metanol, acetona, HCL al 5%, que se preparó con metanol 20mL, acetona 20mL, HCl al 5% 10mL luego la muestra se colocó en el baño ultrasónico por 10minutos, se terminó de aforar con la mezcla anterior. Se tomaron 2mL de esta solución y se colocaron en un tubo para centrifuga.

Se colocó el tubo anterior más otro tubo con la misma masa para que funcionara como contra peso en la centrifugadora durante 10 minutos. Al solido

que quedó se le realizaron dos extracciones más y se colocaron en la centrifugadora durante 5 minutos.

Las tres fases liquidas se colocaron en un balón de 10mL y se aforó con la mezcla anterior.

Se tomó 0,25mL del balón de 10mL y se colocó en un balón de 25mL, se agregaron 15mL de agua destilada, 0,8mL de Folin, se homogenizó el contenido, y se dejó reposar en la oscuridad durante 8 minutos.

Una vez transcurrido el tiempo al balón se le agregó 3,75mL de carbonato de sodio al 7,5%, se llevó a un volumen de 25mL con agua destilada. Se homogenizaron los balones y se mantuvieron en la oscuridad durante 2 horas. La coloración cambió de amarillo a azul. Se midió la absorbancia a 755nm.

Muestra 3

Se tomó 0,25mL del extracto de malanga en metanol, se colocó en un balón de 25mL, se agregaron 15mL de agua destilada, 0,8mL de Folin, se homogenizaron el contenido, y se dejó reposar en la oscuridad durante 8 minutos.

Una vez transcurrido el tiempo al balón se le agrega 3,75mL de carbonato de sodio al 7,5%, se llevó a un volumen de 25mL con agua destilada. Se homogenizaron los balones y se mantuvieron en la oscuridad durante 2 horas.

Método 7. Tubos de ensayo con las 3 muestras

En un tubo de ensayo se le agregaron 5mL de agua, 0,15mL de Folin, 0,15mL de la muestra 1. Se agitó durante 10 minutos, se incubó a temperatura ambiente y se le agrego 0,900mL de sulfito de sodio al 20%.

Se agitó durante 10 minutos, se incubó a 46°C en baño María, Cambió de coloración azul – violeta intenso, las muestras se llevaron a temperatura ambiente con hielo. Se midió la absorbancia a 755nm.

Método 8. Tabletas

Se realizó una formulación para realizar tabletas que contengan como principio activo harina de malanga.

Se pesaron, 16,13g de harina de malanga, 66.47g de Celulosa Micro cristalizada, 1g de Aerosil, 4,5g de PVP, 11g de Veegun y 1g de Estereato de Magnesio.

Se morterizó, se mezcló y se humecto con etanol al 20%, se dejó secar en el horno por una semana a 60 °C.

Resultados y discusiones

Evaluación cromatográfica

Figura 1. Evaluación cromatografica de los extractos de malanga en los solventes

Metanol-Acetato d etilo

La placa mostrada en la figura 2 muestra el desplazamiento de los extractos no polares de la Colocasia Esculenta (A, B,C) obteniéndose una mejor separación el extracto de malanga en metanol, el metanol posee una alta polaridad y el acetato de etilo posee una polaridad intermedia.

Cromatografía de gases acoplado a masas del extracto hexano

El extracto de hexano pasa a ser una parte muy importante del estudio puesto que maneja la parte no polar de las extracciones realizadas cuando se hizo el cromatograma de gases se observa la presencia de tres picos importantes.

Con un tiempo de retención de 24.513 min y un área porcentual relativa de

18.87y un m/z de 42 se pudo encontrar la molécula del campesterol. El pico de 24,874 min tiempo de retención y un área porcentual relativa 23.81 se visualizó la molécula stigmasterol cuyo m/z está reportado en 429. Con un tiempo de retención 25,567 min y un área porcentual relativa de 54.35 se obtuvo la molécula gamma- sitoesterol cuyo m/z corresponde a 431.

Figura 2. Espectrometría de masas extracto malanga-hexano, molécula campesterol

Fuente: elaboración propia

Figura 3. Espectrometría de masas extracto malanga- hexano, molécula stigmasterol

Fuente: elaboración propia

Figura 4. Espectrometría de masas extracto malanga- hexano, molécula sitoesterol

Fuente: elaboración propia

Figura 5. Cromatograma del extracto de malanga en Hexano

Fuente: elaboración propia

Espectro UV- Visible

Figura 6. Espectro de absorción UV- visible correspondiente a la muestra del extracto

metanólico de malanga diluido.

Fuente: elaboración propia

Se reportó un pico en 756nm confirmando la presencia de polifenoles en la muestra dado que según la literatura la absorbancia de los polifenoles se da en 755nm.

Prueba de folin

Figura 7. Muestras de malanga con ácido gálico figura 8.reaccion redox

Muestra de

malanga

Absorbancia 691nm

%

de

polifenoles

seca gramos

totales

0,0700

0,0527

3,21

Cuadro 1. Porcentaje de polifenoles totales en la muestra de malanga

Fuente: elaboración propia

0 ,1

0 ,0 9

f(x ) = 0,07x – 0,01

0 ,0 8

R ² = 1

0 ,0 7

0 ,0 6

0 ,0 5

0 ,0 4

0 ,0 3

0 ,0 2

0 ,0 1

0

0 ,4 0 0

0 ,6 0 0

0 ,8 0 0

1 ,0 0 0

1 ,2 0 0

1 ,4 0 0

1 ,6 0 0

Figura 9. Curva de calibración de ácido gálico mg/L utilizada en la prueba de folin

Producto final tabletas

Figura 10. Tabletas de malanga

Conclusiones y recomendaciones

Conclusiones:

El extracto de Malanga- metanol fue el que disolvió la harina en su mayor parte y este presenta una mayor afinidad por la fase móvil empleada durante la realización de las placas cromatografícas por lo que se utilizó para la realización de las demás pruebas restantes.

Se denotó la presencia de polifenoles en las muestras de malanga (colocasia esculenta) lo cuales poseen una importante actividad antiinflamatoria.

Se puede consumir la malanga (colocasia esculenta) para tratar síntomas menopaúsicos debido a la confirmación de derivados de los fitoesteroles como el campesterol y beta sitoesterol y stigmasterol.

Según los estudios realizados en la literatura la malanga (colocasia esculenta) ayuda a disminuir la hiperlipidemia y protege a nivel cardiovascular.

La malanga (colocasia esculenta) posee acciones terapéuticas, antiisquemicas y antihipertensivas.

La malanga (colocasia esculenta) es un cultivo tropical, no tradicional con un prometedor futuro en el mercado debido a la presencia de potentes antioxidantes como los flavonoides.

Recomendaciones:

1)Realizar una investigación más profunda de los compuestos presentes en la malanga (Colocasia esculenta) como los derivados de los fitoestrógenos debido a que se presentaron resultados promisorios en cuanto a la actividad estrogénica.

2)Utilizar el método DPPH para la determinación de los compuestos polifenolicos presentes en las muestras de malanga (colocasia esculenta).

3)Desarrollar el mismo estudio utilizando distintas partes de la malnaga (colocasia esculenta) como la cascara, las hojas, tallo.

4)Se sugiere que la universidad adquiera un equipo de cámara de estabilidad.

5)Cuantificar los elementos presentes en la malanga (colocasia esculenta) como los polifenoles

6)Se debería realizar investigaciones más completa acerca del contenido de almidón presente en la malanga para preparar distintas fórmulaciones.

7)Realizar estudios farmacocinéticas a la forma farmacéutica para determinar su eficacia y seguridad.

Referencias bibliográficas:

1. .Nelvy Nohemí Rodríguez Montemira.“Determinación de ácido cianhídrico, polifenoles y flavonoides en malanga fresca y procesada (Colocasia esculenta l. schott) “(Químico Farmacéutico Biólogo) UNIVERSIDAD VERACRUZANA Facultad de Química Farmacéutica Biológica/Xalapa, Veracruz.2014.

2.Barrett, O. 1977. Los cultivos tropicales. La Habana, págs. 471 – 475. https://scholar.google.es/scholar?q=malanga+acido+cianhidrico+2014&b tnG=&hl=es&as_sdt=0%2C5 http://cdigital.uv.mx/bitstream/123456789/38507/1/RodriguezMontemira. pdf

3.COVECA (Comisión Veracruzana de Comercialización Agropecuaria). Monografía de la malanga (Colocasia esculenta l. schott). Gobierno del Estado de Veracruz.2010

4.Ferguenson L.R., Michael Fennech, et al. Role of plant polyphenols in genomic stability. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of mutagenesis. ELSEVIER. 2001. Volumen 475. Pags: 475, 89- 111.

5.Ferreres Federico, ui F. on alves, ngel il- zquierdo, atrícia alent o, rtur . S. Silva, Jo o. Silva, Delfim Santos and Paula B. Andrade. Further Knowledge on the Phenolic Profile of Colocasia esculenta (L.) Shott. Journal of Agricultural and Food Chemistry. ACS publication.2012

6.Lin, J.T. Yang, D.J.et al Determination of steroidal saponins in different organs of yam (Dioscorea pseudojaponica Yamamoto). Food chem. ELSEVIER.2008; vol 108: pag:108, 1068-107

7.Reddy, S.K., Katan, M.B. Diet, nutrition and the prevention of hypertension and cardiovascular diseases.Public Health Nutr 2004; 7(1A):167-86.

8.Bardasco Alonso L. Nutrientes y antinutrientes. (Curso básico de Nutrición Clínica). Sociedad de nutrición y dietética de Galicia. Ourense. Abril 2008,

9.Nelvy Nohemí Rodríguez Montemira.“Determinación de ácido cianhídrico, polifenoles y flavonoides en malanga fresca y procesada (Colocasia esculenta l. schott) “(Químico Farmacéutico Biólogo) UNIVERSIDAD VERACRUZANA Facultad de Química Farmacéutica Biológica/Xalapa, Veracruz.2014