1117 – Evaluación comparativa de compuestos lipofílicos en Bidens pilosa y su relación con el potencial farmacológico atribuido a esta planta.

Evaluación comparativa de compuestos lipofílicos en Bidens pilosa
y su relación con el potencial farmacológico atribuido a esta planta.

Adriana Solís Brenes1, Ariadna Arroyo Álvarez2 y Óscar Castro Castillo3

1,2. Licenciadas en Farmacia. Universidad de Iberoamérica (UNIBE), Facultad de

Farmacia.

3. Ph.D en Química. Director de tesis. Facultad Farmacia (UNIBE)

Resumen

Bidens pilosa, es una hierba anual, ampliamente distribuida en nuestro país y conocida popularmente como moriseco, es muy apreciada por sus propiedades medicinales como antimicrobiana y antiinflamatoria para tratar lesiones bucales, antiviral para controlar Herpes simple y para aliviar síntomas asociados a gastritis, colitis y úlceras gástricas.

Dentro de estas consideraciones, el presente trabajo de investigación realizó una evaluación química de las hojas y la raíz secas y molidas de esta planta, distribuyendo primero, de acuerdo a su polaridad, metabolitos secundarios que sintetizan estos materiales botánicos.

Para conseguir este propósito, se obtuvieron extractos de polaridad creciente usando equipo de soxhlet acoplado a condensador enfriado por agua y pasando, durante dos horas consecutivamente, los siguientes solventes orgánicos: Hexano, cloroformo, acetato de etilo y metanol.

Mediante evaluación cromatográfica de capa fina, usando sílica gel como fase estacionaria y diferentes agentes de revelado oxidantes (Vapores de yodo, vainillina ácida y FeCl3 (5%) en combinación con luz ultravioleta de onda corta (265nm) y larga (365nm), se encontró que los extractos que concentraban compuestos no polares (hexano) y poco polares (cloroformo), contenían compuestos poliacetilénicos, los cuales fueron caracterizados parcialmente

combinando técnicas de análisis cromatográfico y espectroscópico. Flavonoides metoxilados también fueron detectados en los extractos de CHCl3 y de acetato de etilo

Se discute, considerando estudios científicos previos, la relevancia farmacológica de estos compuestos y su posible relación con las indicaciones medicinales populares.

Abstract

Bidens pilosa L. an annual herb, widely distributed in our country and popularly known as Moriseco. It is very appreciated for its medicinal properties as antimicrobial and anti- inflammatory to treat oral lesions, antiviral to control Herpes simplex and to relieve symptoms associated with gastritis, colitis and gastric ulcers.

With these considerations, the present research carried out a chemical evaluation of the leaves and root of this plant, distributing first, according to their polarity, secondary metabolites that synthesize these botanical materials.

To achieve this purpose, extracts of increasing polarity were obtained using soxhlet equipment coupled to a water cooled condenser and passing the following organic solvents: Hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol for two hours consecutively.

By means of thin layer chromatographic evaluation using silica gel as a stationary phase and different oxidizing agents (iodine vapors, acid vanillin and FeCl3 (5%) in combination with short wave (265nm) and long (365nm) ultraviolet light, found that extracts concentrating non-polar (hexane) and low polar (chloroform) compounds contained polyacetylene compounds, which were partially characterized by combining chromatographic and spectroscopic analysis techniques. Methoxylated flavonoids also were detected in CHCl3 and ethyl acetate extracts.

The pharmacological relevance of these compounds it is discussed, considering previous scientific studies and their possible relation with popular medicinal indications.

Key Words: Bidens pilosa, polyacetylenes, flavonoids, pharmacological activities

Introducción

Bidens pilosa L. es una especie herbácea anual perenne conocida popularmente en Costa Rica como moriseco, la cual se encuentra ampliamente distribuida casi todos los ambientes tropicales del mundo. Por este motivo, deben existir variaciones genéticas, considerando los diferentes ambientes ecológicos en que crece, con implicaciones importantes en su composición química.

En nuestro país y considerando el área Mesoamericana, los extractos acuosos de las hojas son muy empleados tópicamente para controlar Herpes labial y en gárgaras para tratar infecciones bucales…incluyendo glándulas. También, oralmente es muy reconocida por efectiva, para tratar inflamaciones gastrointestinales relacionadas con colitis y gastritis, siendo notables sus efectos para cicatrizar úlceras.

Nombres populares:

Moriseco y mozote (Costa Rica), romerillo (Cuba), chipacas (Colombia), amor seco y Picao preto (Brasil), margarita silvestre.

Descripción botánica

Hierba anual que crece en nuestro país entre 0-2000m, si acaso alcanza 1m de altura, con hojas enteras o divididas en 5 segmentos ovados o lanceolados con el borde aserrado. Las inflorescencias terminales, tienen cabezuelas con las flores amarillas rodeadas de cinco lígulas o pétalos blancos, semejantes a una margarita. Es fácil de reconocer porque sus semillas negritas se abren sobre el capítulo y se pegan a la ropa mediante las tres cerdas cortas que poseen. De muy fácil distribución y adaptación a variada condiciones ecológicas, común en terrenos baldíos, orilla de carreteras, terrenos yermos y cultivados, márgenes de ríos, zonas tropicales de todo tipo, cerca de las playas y hasta en los tejados de las casas1-3.

Usos populares

En nuestro país, las hojas son muy empleadas para controlar principalmente infecciones bucales relacionadas con virus (Herpes labial) y aftas bucales. Para este propósito, son muy

recomendados tópicamente los macerados acuosos, en el caso de Herpes, y en enjuagues bucales, para eliminar y prevenir comunes infecciones e inflamaciones en laringe y faringe.

Por vía oral, estos extractos son también muy indicados para eliminar a nivel gastrointestinal inflamaciones relacionadas con gastritis y colitis, induciendo un efecto protector de la mucosa gástrica. Otras aplicaciones populares en América y el mundo la indican también para fiebre, angina, diabetes, infecciones y gastroenteritis.

Toda esta variedad de usos populares sugiere que esta planta debe ser un reservorio interesante de principios activos. Sin embargo, aunque se han aislado alrededor de 200 compuestos, sobresalen dos clases de metabolitos secundarios principales: poliacetilenos y flavonoides como los principales agentes responsables de las sugerencias medicinales populares4,5,6.

Constituyentes químicos6,7

En los poliacetilenos destacan dos clases: los que tienen un anillo aromático como el 7-fenil- 2, 4, 6-heptatriino, al cual se le atribuyen las propiedades antitumorales y antimicrobiales y, los alifáticos, todos de 13 átomos de carbono, distribuidos en toda la planta, aunque se concentran en mayor cantidad en la raíz.

Los flavonoides se presentan principalmente como flavonoles y flavonas penta y tetraoxigenados y algunas glicosidados en el carbono-7. Particularmente, los más activos contra malaria fueron los flavonoles 3, 5, 7, 3’, 4’-pentaoxigenados (derivados de quercetina) glicosilados em posição7. También se han identificado flavonas tri y tetrahidroxiladas derivadas de luteonina y apigenina, los cuales justifican las propiedades antitumorales relacionadas con efectos antioxidantes.

Usos populares apoyados en evidencias científicas y datos clínicos

Actividad antiinflamatoria (asma, reumatismo y conjuntivitis)8-10, malaria11 , actividad antitumoral y su relación con la presencia de flavonoides muy oxigenados y su potencial antioxidante12,13 , acción hipotensiva y vascular14,15, antihipeglicémico16 , inhibición del crecimientos de hongos y baterías patógenas (alquinos fotosensibles y compuestos con fenoles libres)17, protección antiulcerogénica, hepatoprotectora y cicatrizante (flavonoides)18,

potencial viricida, anti-herpético (poliinos activados con luz ultravioleta.)19 y control de parásitos del género Eimeria, que da lugar a la coccidiosis, enfermedad de gran impacto económico en aves de corral por su mortalidad y altos costos de control. Y protección a mucosa gástrica para prevenir y tratar gastritis y colitis20. Todas estas investigaciones han sido discutidas ampliamente en la literatura científica.

Dado la fácil adaptación de esta planta en diferentes ambientes ecológicos de nuestro país (crece de los 0-2000m), se propone en este trabajo verificar la presencia de poliinos y flavonoides en la Bidens pilosa que crece de manera silvestre en la Meseta Central de Costa Rica, que permitan justificar las bondades medicinales que se le atribuyen a esta planta.

Materiales y métodos

Dada la fácil adaptación de esta planta en diferentes ambientes ecológicos de nuestro país (crece de los 0-2000m), se propuso en este trabajo, verificar la presencia de poliinos y flavonoides en la Bidens pilosa L. que crece de manera silvestre en la Meseta Central de Costa Rica, para justificar parte de las bondades medicinales populares que se le atribuyen a esta planta.

Tipo de estudio

Hipotético/deductivo. Se consideraron resultados discutidos en la literatura para formular la hipótesis y justificación. También, es analítico experimental, porque se obtuvieron datos mediante pruebas de laboratorio, los cuales fueron interpretados por comparación con análogos discutidos en la literatura científica para la misma planta o especies afines en otros países.

La investigación se realizó en laboratorios de la Universidad de Iberoamérica (UNIBE) entre marzo del 2016 y agosto del 2017. Las muestras de Bidens pilosa fueron recolectadas en Tibás, San José, con la planta en floración y fue clasificada por Dr. Óscar Castro C.

Métodos de extracción

Se emplearon los siguientes dos métodos

Primero, las hojas y la raíz secas y molidas fueron extraídas en equipo soxhlet usando por dos horas en cada caso, los siguientes solventes de polaridad creciente: hexano (A), cloroformo (B), acetato de etilo (C) y metanol (D).

Segundo, usando ambos materiales botánicos, se realizaron 4 procedimientos empleando en todos los casos 30g de material fresco y picado.

En el primer caso (Decocción), los materiales se calentaron en agua hasta ebullición por 20min y luego fríos se extrajeron consecutivamente con éter etílico y luego con acetato de etilo. Ambos extractos concentrados mediante destilación con vacío a temperatura menor a 50oC, fueron denominados como (A1) y (B1).

Segundo procedimiento los materiales mezclados con agua, se licuaron y se dejaron macerando por 2 horas (Maceración). Luego se extrajeron con los mismos solventes anteriores, se concentraron como antes y se nombraron como (A2) y (B2)

Tercer procedimiento fue igual que el primero (decocción), pero en este caso usando etanol en lugar de agua. Se nombraron en este caso (A3) y (B3).

Cuarto procedimiento los materiales se dejaron macerando con éter etílico por 2 horas. Se filtraron y luego se dejaron macerar por una hora más también con éter etílico. Después, a los materiales botánicos residuales se les extrajo por maceración, dos veces consecutivas con acetato de etilo. Una vez concentrados se colocaron en frascos de vidrio y se etiquetaron con las letras (A4) y (B4).

Evaluación cromatográfica de capa fina

En todos los casos se usaron cromatoplacas producidas por Aldrich con fase estacionaria de sílica gel las cuales se cortaron con dimensiones de 4 cm de ancho x 8 cm de largo. Los diferentes extractos se aplicaron con un capilar, 1 cm arriba de la base de la placa y se dejaron ascender por capilaridad hasta llegar 1cm antes del borde superior.

Se realizaron diferentes evaluaciones comparativas, explorando como fases móviles; CHCl3 y mezclas de polaridad creciente CHCl3 / Metanol (95:5), (90:10) y (80:20). También mezclas de Hexano/ CHCl3 (1:1).

Todas las cromatoplacas fueron aplicadas con los diferentes extractos, teniéndose el cuidado de que las aplicaciones quedaran siempre por encima de la fase móvil a experimentar y que esta recorriera siempre 6cm.

Una vez secas se evaluaban empleando los siguientes principales agentes de revelado:

Luz Ultravioleta: Onda corta (265nm) y larga (365nm)., Vainillina Ácida., Vapores de Yodo y Cloruro de Hierro (III) al 10%.

Evaluación de resultados

Con la fase móvil CHCl3 /hexano (1:1), se separan tanto en la raíz como en las hojas varios compuestos, cuya fosforescencia celeste y plateada, observada con luz ultravioleta de onda larga (365nm), sugiere la presencia de poliacetilenos no polares y poco polares, concentrándose estos últimos en la raíz. Inclusive, se puede observar que la raíz sintetiza mucha mayor cantidad de esta clase de compuestos que las hojas.

Es posible observar que con esta fase móvil, se separan en el extracto hexánico (A), con gran resolución, 4 compuestos de diferente polaridad, Rf = 0.93 (no polar), Rf= 0.39 y Rf= 0.29 (poco polares) y uno polar que queda casi en la base Rf= 0.07, en los cuales fosforescen celeste con aureola plateada, mientras que en el correspondiente extracto hexánico (A) de las hojas solo se observa un compuesto diferente, el cual fosforesce azul tenue con Rf = 0.46.

Mientras que en el extracto de cloroformo (B), se concentran tres compuestos mayoritarios que fosforescen plateado, los cuales, pero en menor cantidad se sintetizan también en las hojas.

Como observación importante ninguno de estos compuestos reveló con todos los reactivos oxidantes empleados: vainillina ácida, vapores de yodo ni FeCl3 (5%), ni se encuentran presentes en el extracto hexánico de las hojas. Figura 1.

Hojas

Raíz

A B C D

A B C D

Figura 1. Evaluación cromatográfica comparativa de los extractos (A), (B), (C) y (D)

obtenidos de las hojas y la raiz , revelados con luz UV (365nm) y corridos con la fase móvil

CHCl3 /hexano (1:1).

Estos mismos extractos (A) y (B), ahora empleando como fase móvil solo cloroformose nota que los 4 cuatro compuestos antes observados en la raíz en el extracto hexánico (A), se juntan en el frente de la placa.

No obstante, ahora el cloroformo, permite separar, tanto de las hojas como de la raíz, los 3 principales compuestos más polares que presentan una florescencia plateada, los cuales por coincidir en Rf deben ser los mismos.

Las bandas color rojo observadas en el UV onda larga (365nm) de las hojas, corresponden a los pigmentos clorofílicos que necesita la plantas para hacer fotosíntesis. Figura 2.

Hojas

Raíz

A B C D

A B C D

Figura 2. Evaluación cromatográfica comparativa de los extractos (A), (B), (C) y (D) de las hojas y la raíz, revelados con luz UV (365nm) y corridos con la fase móvil CHCl3.

Con luz UV de onda corta (365nm), resulta clara la separación de por lo menos tres compuestos presentes en los extractos (A(, (B) y(C) de las hojas, de los cuales solo el de mayor Rf revela con FeCl3 (5%) indicando la posible presencia en las hojas de flavonoides metoxilados. Estas manchas no se observan en la raíz. Figura 3.

(Hojas)(Hojas)

A B C D

UV (365nm)

A B C D

FeCl3 (5%)

Figura 3. Evaluación cromatográfica comparativa de los extractos (A), (B), (C) y (D) obtenidos de hojas revelados, con UV (265nm) y FeCl3 (5%), en fase móvil de CHCl3.

Estas evidencias permiten concluir que tanto las hojas como la raíz sintetizan poliacetilenos no polares y poco polares, los cuales se pueden separar con estas dos fases móviles y que solo las hojas producen compuestos con funciones fenólicas libres (reaccionan con FeCl3 (5%), y que por ser tan poco polares deben ser flavonoides con varias funciones metoxiladas, como centaureidin (I). reportado previamente para una especie de Bidens pilosa análoga.

Espectros UV-Visible y Desplazamientos batocrómicos

En este análisis se utilizó un espectrómetro UV-Visible, marca Cary 60, modelo MY14030002 y una cubeta de cuarzo con 1cm de paso óptico 4mL de capacidad.

El espectros UV del extracto de acetato de etilo (C), libre de poliacetilenos aromáticos, mostró las bandas de absorción que caracterizan este tipo de flavonas (α = 271, 308 y 330nm) con desplazamiento batocrómico al agregar NaOH de 330nm hasta 380nm, reversible en medio ácido, demostrando que tiene funciones fenólicas libres)

El espectro IR caracterizó las funciones fenólicas (µ= 3332cm-1 banda anncha), el carbonilo

αy β-insaturado (µ= 1689 y 1620cm-1 Vibraciones intensas de parecida intensidad), el sistema aromático (µ= 1602 y 1514cm-1 C=C de anillos aromáticos) y las funciones éter (µ= 1172, 1117 y 1069cm-1 estiramiento C-O-C de éter). Estos datos coinciden con los atribuibles a una flavona como centaureidin.

Los extracto (C) y (D) no se discuten en este trabajo de investigación, porque fueron investigados previamente en otros proyectos dirigidos por el Dr. Óscar Castro C en UNIBE. Se demostró que el extracto (D) es particularmente rico en compuestos fenólicos y flavonoides glicosidados.

Conclusiones

De acuerdo a la literatura científica revisada, los principales compuestos bioactivos de esta planta son poliinos (no polares y muy polares) y flavonoides de diferente polaridad, los responsables de las principales propiedades medicinales atribuidas popularmente a las hojas de esta planta (Bidens pilosa).

Los diferentes métodos de extracción utilizados: tanto utilizando equipo de extracción continua (usando equipo soxhlet) y pasando solventes orgánicos de polaridad creciente, como las decocciones con agua y etanol y la maceración en frío, evaluados por métodos analíticos de cromatografía de capa fina con fase estacionaria de sílica gel y revelando con reactivos específicos como FeCl3 (5%) y exponiendo las placas a la luz UV indicaron que los compuestos poliacetilénicos no polares se concentraban en los solventes no polares (hexano) y poco polares (CHCl3).

No obstante, se encontró, que los materiales botánicos investigados (hojas y raíz), cuando se maceraban directamente con éter etílico, concentraban mayor cantidad de poliacetilenos poco polares.

Esto pone en evidencia, como previsible, que las funciones acetilénicas de estos compuestos son muy sensibles a la luz y al calor.

De seguro esta clase de compuestos se excitan muy fácilmente en presencia de luz (visible y UV) y en este estado excitado potencian su efecto farmacológico.

Acordarse de que este virus es muy común en humanos, permanece latente y basta una alteración del sistema inmunológico para que prolifere rápidamente.

La evaluación comparativa por cromatografía de capa fina en sílica gel, usando principalmente como fases móviles: CHCl3 / MeOH (95: 5) y (90: 10) y como agente de revelado FeCl3 (5%), indicaron que tanto los extractos clorofórmicos como los de acetato de etilo concentran compuestos con funciones fenólicas libres comunes en flavonoides.

Investigaciones anteriores realizadas en UNIBE, con extractos derivados de las hojas de Bidens pilosa, demostraron que tiene relevante potencial antioxidante, bacteriostático, antiinflamatorio y antiulceroso.

Los compuestos mayoritarios identificados corresponden a poliacetilenos aromáticos y al flavonoide metoxilado centaureidin. Figura 4.

OH

CH2 – R

HO

O

OCH3

(1) R = H Fenilheptatriino

CH3O

OCH3

(2) R = OH

(3) R = OAc

OH O

Centaureidin

Figura 4. Principales compuestos identificados en hojas y raiz de Gliricidian sepium L.

Recomendaciones

Dado que esta planta crece como una hierba durante todo el año y se encuentra ampliamente distribuida en diferentes condiciones ambientales del país, recomendamos:

a)Adaptar una metodología capaz de cuantificar la presencia de poliacetilenos en los extractos no polares y muy polares de B. pilosa.

b)Verificar si existen diferencias significativas en composición dependiendo de las condiciones ecológicas donde crezca esta planta.

c)Determinar cuál es la abundancia relativa de los flavonoides poco polares (altamente metoxilados) presentes en extractos poco polares.

d)Hacer reacciones de hidrólisis, empleando extractos hidroalcohólicos, acuosos y etanólicos derivados de las hojas y raíces. Extraer las agliconas de flavonoides con acetato de etilo y caracterizarlas.

e)Evaluar comparativamente el potencial medicinal de cada uno de estos extractos por separado y compararlos con los extractos crudos de la planta, para visualizar posibles efectos sinérgicos.

f)Aprovechar esta planta de tan reconocido potencial medicinal, tradicional y farmacológico, demostrados con ensayos in Vivo e in Vitro, para formular productos de interés medicinal.

Bibliografía

1.Esteban Núnez y Meléndez. Plantas Medicinales de Costa Rica y su Folclore. Editorial Universidad de Costa Rica. 1978, p.126

2.Juan Tomás Roig. Plantas medicinales aromáticas o venenosas de Cuba. Editorial Científico Técnica, La Habana-Cuba. 1989. P. 801.803

3.Jorge León y Luis J. Poveda. Nombres comunes de las plantas en Costa Rica. Editorial Guayacán. 2000. P.471-2

4.Josselyn Hernández Solis y Gerardo Quesada Bonilla.Evaluación del potencial de extractos obtenidos a partir de las hojas de Bidens Pilosa como bacteriostático y para tratamiento en gastritis. Trabajo de graduación para optar al grado de Licenciatura en Farmacia. UNIBE. Costa Rica. 2009

5.Marianela Hernández Chaves Evaluación del potencial gastroprotector de los extractos ricos en compuestos polifenólicos, obtenidos a partir de las hojas de Bidens pilosa (Fam. Asteraceae). Trabajo de graduación para optar al grado de Licenciatura en Farmacia. UNIBE. Costa Rica. 2010.

6.Benjamin Gilbert., Lucio Ferreira Alves e Rita Favoreto. Bidens piiosa L Asteraceae (Compositae., Subfamilia Heliantheae). Monografía. Revista Fitos. Río de Janeiro.vol. 8(1): 1-53-67. 2013.

7.Geissberger, P. and U. Sequin. Constituents of Bidens pilosa L.: do the components found should explain the use of this plant in traditional medicine? Acta Trop. 48: 251–261, 1991.

8.Pereira, R.L.C., T. Ibrahim, L. Lucchetti, A.J.R. da Silva and V.L.G. de Moraes. Immunosuppressive and anti-inflammatory effects of methanolic extract and the polyacetylene isolated from Bidens pilosa L. Immuno-pharmacology 43: 31–37, 1999.

9.Jager, A.K., A. Hutchings and J. van Staden. Screening of Zulu medicinal plants for prostaglandin synthesis inhibitors. J. Ethnopharmacol. 52: 95–100, 1996.

10.Chih, H.W., C.C. Lin and K.S. Tang. Anti-inflammatory activity of Taiwan folk medicine “ham-

hongchho” in rats. Am. J. Chin. Med. 23: 273–278, 1995

11.Brandão, M.G.L., A.U. Krettli, L.S.R. Soares, C.G.C. Nery and H.C. Marinuzzi. Antimalarial activity of extracts and fractions from Bidens and other Bidens species (Asteraceae) correlated with the presence of acetylene and flavonoid compounds. J. Ethnopharmacol. 57: 131–138, 1997.

12.Priyanka Kumari, Kanak Misra, Brijesh Singh Sisodia, Uzma Faridi, Suchita Srivastava, Suiab Luqman, Mahendra Pandurang Darokar, Arvind Singh Negi, Madan Mohan Gupta, Subhash Chandra Singh, Jonnala Kotesh Kumar A Promising Anticancer and Antimalarial Component from the Leaves of Bidens pilosa. Planta Med. 2009, 75: 59-61.

13.Parimalakrishnan Sundararajan*, Akalanka Dey, Anton Smith. Studies of anticancer and antipyretic activity of Bidens pilosa whole plant. African Health Sciences Vol 6 No 1 March 2006

14.T. Dimo., T. B. Nguelefack-. P. V. Tan., M. P. Yewah., E. Dongo., S. V. Rakotonirina., A

.Kamanyi, and M. Bopelet. Possible Mechanisms of Action of the Neutral Extract from Bidens pilosa

L. Leaves on the Cardiovascular System of Anaesthetized Rats. Phytother. Res. 17, 1135–1139 (2003).

15.Dimo, T., S. Rakotonirina, R. Kamgang, P.V. Tan, A. Kamanyi and M. Bopelet. Effects of leaf aqueous extract of Bidens pilosa (Asteraceae) KCl- and norepinephrine-induced contractions of rat aorta. J. Ethnopharmacol. 60: 179–182, 1998.

16.Ubillas, R.P., C.D. Méndez, S.D. Jolad, J. Luo, S.R. King, T.J. Carlson and D.M. Fort. Antihyperglycemic acetylenic glucosides from Bidens pilosa. Planta Med. 66: 82–83, 2000.

17.Rabe, T. and J. van Staden. Antibacterial activity of South African plants used for medicinal purposes. J. Ethnopharmacol. 56: 81–87, 1997.

18.Chin, H.W., C.C. Lin and K.S. Tang. Hepatoprotective effects of Taiwan folk medicine ham- hongchho in rats. Am. J. Chin. Med. 24: 231–240, 1996.

19.Lien-Chai Chiang, Jung-San Chang, Chi-Chain Chen,Lean-Teik Ng and Chun-Ching Lin. Anti-

Herpes Simplex Virus Activity of Bidens pilosa and Houttuynia cordata. The American Journal of Chinese Medicine, Vol. 31, No. 3, 355–362 (2003).

20.W.C. Yang , Y.J. Tien , C.Y. Chung , Y.C. Chen ,W.H. Chiou , S.Y. Hsu , H.Y. Liu , C.L. Liang, C.L.T. Chang. Effect of Bidens pilosa on infection and drug resistance of Eimeria in chicken.

Research in Veterinary Science 98 (2015) 74–81.