Estudio de la estabilidad molecular de tabletas de warfarina en formulaciones existentes

Estudio de la estabilidad molecular de tabletas de warfarina en formulaciones existentes

Phd. Eduardo Arguedas Chaverri
MBA Karolina González Villalobos

El objetivo de la investigación es estudiar la inestabilidad de medicamentos como la warfarina en condiciones determinadas. La parte experimental consistió en extraer el principio activo de tabletas de diferentes casas farmacéuticas y se analizó su comportamiento al exponerse a condiciones en las cuales se dio una hidrólisis en la molécula. El análisis se dio por medio de espectroscopia infrarroja y ultravioleta.
El hallazgo más relevante fue que la molécula sufre modificaciones estructurales en medio acuoso y se recomienda un control en las condiciones ambientales y químicas para eliminar la presencia de agua. Esto se evidenció tanto en el proceso de hidrólisis a la cual se sometió los comprimidos, como en el proceso de extracción de la warfarina, donde los solventes debían estar sin agua, para no interferir con los análisis y que no se diera una temprana hidrólisis en la molécula. Se recomienda además estudiar la estabilidad de la molécula en el almacenamiento, transporte y manipulación del medicamento.

La warfarina es un derivado sintético de la cumarina, sustancia que se encuentra en algunas plantas de forma natural. Es una mezcla racémica de dos isómeros ópticos activos; la S-warfarina y R¬warfarina. Siendo el primer isómero cinco veces más potente en el antagonismo de la vitamina K que el segundo. Véase figura 1. (2)
La warfarina como anticoagulantes oral ha demostrado eficacia en el tratamiento de transtornos como la Trombosis Venenosa Profunda y el Trombo Embolismo Pulmonar y es el anticuagulante más recetado en Norteamérica (3) Entre las deficiencias del tratamiento con Warfarina es que este interactúa con muchos medicamentos comunes e inclusive con alimentos, por lo que se debe hacer un seguimiento en su uso.

Fig. 1 Estructura de la warfarina.
Fuente: http://www.warfanna.com
Uno de los puntos de interés es estudiar la estabilidad del medicamento ya que ante una alteración del principio activo o excipientes; se puede comprometer la acción terapéutica del medicamento, se pueden generar compuestos potencialmente tóxicos o bien se alteran las propiedades organolépticas del medicamento.
El estudio de inestabilidad se puede realizar en la etapa de pre-formulación, sin embargo, en este

estudio, el procedimiento de determinación de los factores que afectan a la warfarina, se realizó en fase sólida.
Estos factores son; humedad y pH. La humedad; que es el factor estudiado en esta investigación, afecta, ya que las partículas del fármaco absorben el agua generando una capa saturada de éste (teoría de la capa húmeda). Este modelo que supone que la descomposición del fármaco sólo tiene lugar en dicha capa es el denominado Leeson-Mattocks. (4).
El pH influye porque generalmente la warfarina se administra como una sal sódica y algunos modelos consideran que está tamponada y que puede existir sensibilidad al pH.
El mecanismo de descomposicón del fármaco sería a través de una reacción con agua conocida como hidrólisis. Cuando una molécula posee en su estructura grupos éster; como es el caso de la molécula de warfarina, es más propenso a sufrir este tipo de reacción. Esta reacción puede ser acelerada por catálisis ácida o catálisis básica, debido a la presencia de hidrogeniones o hidroxilos respectivamente. La catálisis puede deberse también a la presencia de especies ácidas y básicas en las mezclas amortiguadoras o bien al disociarse. el agua en iones hidronio e hidroxilo; éstos se unen a los iones constituyentes de las sales disueltas en el agua formando especies ácidas o básicas que modifican el pH de la disolución.(4) Las sales de ácidos débiles o bases débiles tienen a hidrolizarse de una forma mayor entre más débil sea el ácido o la base que las originó.

La hidrólisis de un fármaco posee otros agentes catalíticos como son el calor, la luz y la misma concentración del principio activo.
Otros mecanismos de descomposición del fármaco son a través de la oxidación, la descomposición fotoquímica y la polimerización.
Metodología
Para este estudio se utilizaron pastillas provenientes de dos laboratorios, una de 1mg de un laboratorio israelí y una segunda pastillas de 5 mg de un laboratorio canadiense. Se extrajo de cada pastilla el principio activo y se analizó la molécula con el uso de análisis espectroscópicos IR y UV. La extracción se realizó en seis oportunidades, variando condiciones de extracción en cada una de ellas.
El primer estudio consistió en extraer la warfarina de las pastillas y a la vez analizar los extractos para comprobar la presencia de la warfarina en los mismos.
La primera extracción se realizó en presencia de acetona ligeramente acidulada como disolvente y el extracto se analizó con espectroscopia IR y UV.
En la segunda extracción, se utilizó acetona pero en este caso anhidra, al secarse utilizando sulfato de sodio. Este extracto de igual manera fue analizado con IR y UV.
La tercera extracción se varía el procedimiento colocando el disolvente (acetona anhidra) en contacto con las pastillas durante una hora en reflujo.
En la cuarta extracción se realizó el mismo procedimiento de la extracción anterior pero el disolvente se trató por tres días, para eliminar completamente el agua. Se analizó por UV, IR y en este caso también por RM N.

Con estos análisis se logró comprobar una efectiva extracción de la molécula de warfarina y cuál es el estado de la misma en los comprimidos cuando éstos son recién sacados del blister.
Para el estudio de la inestabilidad de la fase sólida los comprimidos se sometieron a una reacción de hidrólisis. Los comprimidos primeramente se pusieron en contacto con NaOH en baño maría por una hora y se extrajeron con acetona y se colocaron en reflujo por cuatro horas con acetona anhidra. Se analizaron con UV, IR y RMN.
Para efectuar una cinética se tomaron muestras de
la extracción cinco y se sometieron a calor agregando una gota de HCI cada 30 minutos por un periodo de 2 horas. Las muestras se diluyeron en agua y se realizaron las lecturas en el ultravioleta.

Resultados y discusión
Al estudiarla inestabilidad de la molécula de warfarina y hacer una cinética de la misma, se tuvo como primer hallazgo la necesidad de secar el acetona y que quedara libre de agua, ya que el agua no permitía leer las absorciones correspondientes en el infrarrojo y que se daba una hidrólisis del éster cíclico dando reordenamientos químicos.
La prueba de la interferencia del agua se observó en los espectros UV, dándose un efecto isocrómico sobre la banda en los 269nm y ésta se desplaza a 238,37 nm, como se observa en la figura siguiente.

Fig 2 Espectro UV molécula warfarina.
El reordenamiento es evidente en el espectro IR a continuación, donde se detectaron los grupos fenoles y alcoholes en la banda a 3344,05 cm-1, la presencia de un alcohol vinílico a 1688,73 cm-1, un alcohol secundario 1618,64 cm-1 y se observan los sistemas insaturados en 1452,5 cm-1,875,14 cm-1 y 900 cm-1.

Fig 3 Espectro IR molécula warfarina

No hubo diferencia significativa en las dos tabletas usadas; tanto la proveniente del laboratorio israelí como la del laboratorio canadiense mostraron los mismos comportamientos en los espectros.
Como se explicó en la metodología se secó la acetona para obtener la molécula de una forma más visible e los espectros. Nuevamente se observaron la presencia de las bandas características de los alcoholes y fenoles en 3369,67 cm-1, una banda e insaturación en 2955,83 cm’, banda no detectada antes. A 2915,78 y 2848,15 cm-‘se representan los grupos alquilo y a 1737,11 cm-1 se ven las bandas producto de las vibraciones de alargamiento de los grupos éster cíclicos insaturados y en 1702,08 cm-1 la presencia de cetonas no conjugadas. Se observaron los sistemas aromáticos en 876,67 cm-1 y 948,30 cm-1. Finalmente en 1622 cm-1 se ven las vibraciones relacionadas con los sistemas aromáticos disustituídos. Todas las señales fueron detectadas de una forma más limpia en este extracto, gracias al uso del disolvente anhidro. Como se observa en a figura 4.

Fig 4 Espectro UV molécula warfarina con acetona anhidra
El espectro UV muestra absorciones de 206,77 nm y 269,09 nm características de la warfarina. Tanto el espectro IR como el espectro UV dan resultados congruentes con los esperados para la molécula de la warfarina. Como se observa en la figura 5

Fig 5 Espectro IR molécula warfarina con acetona anhidra
El uso del rotavapor no fue suficiente para eliminar el agua al realizar las extracciones, la presencia de la misma y el calentamiento a la que es sometida la muestra para su secado, provoca una degradación debido a una hidrólisis en medio ácido y se da el reordenamiento de la molécula; el medio ácido se debe a la presencia de ácido láctico en la formulación. Los espectros IR y UV confirmaron el reordenamiento molecular, en este punto de la investigación se determinó que el secado del disolvente era de mucha importancia al realizar la correcta extracción de la warfarina y se extrapoló este resultado a la importancia de un correcto almacenamiento de los comprimidos; ya que en presencia de humedad por un periodo prolongado pueden darse las condiciones para el reordenamiento molecular.

Las lecturas UV e IR de la warfarina extraídas con un disolvente cuyo contacto con el sulfato de sodio anhidro fue prolongado; muestran las absorciones de 206,71 nm y 268,86 nm para el UV y en el IR se muestra a 3500 cm-1 la presencia de un alcohol vinílico y la presencia de grupos alquil en 2958cm-1, 2916 cm-1, 2873 cm-1 y 2848 cm-1. En 1709 cm-1, 1720 cm-1 y 1736 cm-1 se muestran respectivamente la presencia de la cetona no conjugada, la presencia de la porción de molécula que generó cetona por medio de un equilibrio ceto enólico y la presencia del éster cíclico e insaturado de seis unidades.

Fig 6 Espectro IR molécula reordenada

Fig 7 Espectro UV molécula reordenada

Por otra parte al realizar la hidrólisis básica intencional, los resultados que se obtuvieron en el IR para las tabletas israelíes la presencia de ácidos carboxílicos en la banda que va de 2958,65 cm-1 a 2800 cm-1, al igual que se observa en la banda 3383,99 cm-1, los grupos OH del sistema enólico, en 1702 cm-1 se ve la presencia de la cetona de la cadena lateral y en 1668 cm-1 la banda correspondiente al ácido carboxílico conjugado.
En el UV se muestra la banda a 226,27 nm que demuestra la presencia de la conjugación del grupo enólico con respecto del ácido.

Fig 8 Espectro UV para la molécula hidrolizada, tableta israelí

Fig 9 Espectro IR para molécula hidrolizada, tableta israelí

Al analizar las tabletas canadienses, los resultados que se obtuvieron en el IR muestran la presencia de todo el sistema de ácido carboxílico en la banda ancha que va de 3353,89 cm-1 a 2800 cm-1, en 1702,57 cm-1 se ve la presencia de la cetona de la cadena lateral y en 1643 cm-1 la banda correspondiente al ácido carboxílico ligeramente menos conjugado. Finalmente en 1365 cm-1 se muestra un hemiacetal cíclico producto del reordenamiento molecular.

Fig.10 Espectro IR para molécula hidrolizada, tableta canadiense.

Fig 11 Espectro UV para la molécula hidrolizada, tableta israelí
En el UV se muestra la banda a 226,27 nm que relaciona la conjugación del grupo enólico a un sistema ácido.

Fig 12 a. Warfarina, b. Molécula de warfarina reordenada y c. Molécula abierta hemiacetálica
Para analizar el comportamiento de la hidrólisis de la warfarina con el tiempo, se realizó la hidrólisis de la tableta canadiense y como se explicó en la metodología se hizo seguimiento por medio de UV cada 30 minutos por un lapso de dos horas.

A tiempo cero, se observaron los dos grupos de bandas de la warfarina sin hidrolizar que son 205,4 nm y 269,26 nm. A los 30 minutos se observa la presencia de los sistemas aromáticos a 201 nm, el sistema de doble enlace conjugado vinílico a 229,62nm y el sistema de cadena abierta del ácido a 239,89 nm. Al cabo de una hora se da un desplazamiento de las bandas, dando 210 nm por la insaturación del sistema enólico con un efecto isocrómico, pero se obtiene un efecto batocrómico hacia 264,84 nm por la formación del nuevo éster. A la 1,5 horas se comporta igual y para las 2 horas la banda a 210 nm desaparece, lo cual implica el reordenamiento de la molécula a un sistema ácido de cadena abierta.

Conclusiones y recomendaciones.
La inestabilidad que se estudió en esta investigación; clasifica como una inestabilidad química, al interactuar la warfarina con el agua y el reordenamiento de la molécula es detectable e identificada a través de métodos instrumentales como IR y UV.
La molécula de warfarina en medio acuoso es inestable; pasa por una reacción de hidrólisis que reordena la misma pudiendo cambiar su actividad farmacológica.
Un punto crítico es al realizar la extracción de la warfarina es utilizar disolventes anhidros. A su vez colocar la muestra extraída a reflujar como un tratamiento posterior, mejora la detección de los grupos funcionales de la molécula.
Las tabletas estudiadas de las dos casas farmacéuticas, no presentaron diferencias significativas en su comportamiento en este estudio. En los resultados los mejores resultados de extracción si dependieron del método de extracción.

Se recomienda:
Emplear elementos para la formulación de tabletas de warfarina, que sean libres de agua.
Comprobada la inestabilidad de la warfarina con el agua, se recomienda cuidar las condiciones de almacenamiento, transporte y adecuar el envase para evitar el contacto con el agua.

Realizar estudios de equivalencia química para compuestos que muestran inestabilidad, principalmente por interacción del principio activo con alguno de los excipientes.
Realizar estudios sobre la consecuencia farmacoterapéutica que la molécula hidrolizada puede tener en el tratamiento de un paciente.

Evaluar la manera de prolongar la vida útil de los medicamentos y retardar la degradación de los mismos al ser adquiridos.
Referencias
1.            Arguedas, E. Consulta a experto. Heredia, BIOPROCESOS 2010-2014
2.            Alfaro M y Solano A. Estabilidad Molecular de la Warfarina en Formulaciones Existentes. (Trabajo de investigación para optar por el grado de licenciatura en farmacia). San José, Costa Rica: UNIBE; octubre 2011
3.            Warfarina.com (accesado enero, 2014) Disponible en http://www.warfarina.com
4.            Vila J. Tecnología Farmacéutica Volumen II: Formas Farmacéuticas. España: Editorial Síntesis.2001 p.449-454